Scientific Kalender Juli 2018

Was ist der Unterschied zwischen den Lyse- und Färbeverfahren für Leukozyten in den Kanälen WDF und WPC? Das Lysereagenz des WPC-Kanals hat eine stärkere Wirkung auf die Membranlipide. Die Inkubationszeit des Surfactants ist länger, das Fluoreszenzreagenz hat eine höhere Polymethinkonzentration und die DNA des Kerns wird im WPC-Kanal markiert.
Das Lysereagenz des WDF-Kanals hat eine stärkere Wirkung auf die Membranlipide. Die Inkubationszeit des Surfactants ist länger, das Fluoreszenzreagenz hat eine höhere Polymethinkonzentration und die DNA des Kerns wird im WDF-Kanal markiert.
Das Lysereagenz des WPC-Kanals hat eine stärkere Wirkung auf die Membranlipide. Die Inkubationszeit des Surfactants ist länger, das Fluoreszenzreagenz hat eine geringere Polymethinkonzentration und die RNA des Zytoplasmas wird im WPC-Kanal markiert.
Das Lysereagenz des WDF-Kanals hat eine stärkere Wirkung auf die Membranlipide. Die Inkubationszeit des Surfactants ist kürzer, das Fluoreszenzreagenz hat eine höhere Polymethinkonzentration und die DNA des Kerns wird im WDF-Kanal markiert.

Wissenschaftliche Hintergrundinformationen

Die Kombination der Analysekanäle WDF und WPC mittels Fluoreszenz-Durchflusszytometrie in einem einzigen Analysesystem ermöglicht es, reaktive und maligne Zellen mit hoher Spezifität und Sensitivität nachzuweisen. Hierzu werden die Unterschiede in der Zellfunktion der verschiedenen Leukozytenarten ausgenutzt.
Im WDF-Kanal (White Blood Cell Differential, Leukozyten-Differenzialblutbild) hängt die Fluorochrom-Markierung von der Membranzusammensetzung und dem zytoplasmatischen Gehalt der Leukozyten ab. Die Zusammensetzung der Lipidmembran von aktivierten oder unreifen Zellen unterscheidet sich von derjenigen nicht-reaktiver und reifer Zellen. Eine besondere Kombination von Reagenzien (Lyse und Markierung) und Inkubationszeit gestattet die Trennung verschiedener Zellpopulationen. Zunächst perforiert das Lysereagenz die Zellmembranen, wobei der Grad der Membranschädigung von der Lipidzusammensetzung abhängt, die wiederum vom Zelltyp (Reifegrad) und dem Zustand der Zelle (Aktivierungsstatus) abhängig ist. Danach wird hauptsächlich RNA im Zytoplasma mit dem Fluorochrom-Marker markiert. Die Intensität des resultierenden Fluoreszenzsignals hängt vom Grad der Membranperforation (Lipidzusammensetzung) und der Gesamtmenge an RNA im Zytoplasma ab. Die Informationen über die Membranzusammensetzung und die zytoplasmatische RNA (Fluoreszenz), das Zellvolumen (Vorwärtsstreuung) und die intrazelluläre Struktur (Seitenstreuung) werden mit proprietären Algorithmen analysiert, die einen Nachweis von reaktiven, unreifen oder pathologischen Zellen in einer Blutprobe mit hoher Sensitivität erlauben.

Das Lysereagenz des WPC-Kanals wirkt stärker auf die Membranlipide, da es einen anderen Surfactant enthält und die Inkubationszeit im Vergleich zum WDF-Kanal länger ist. Zudem besitzt das Fluoreszenzreagenz eine höhere Polymethinkonzentration, sodass die Kern-DNA
markiert wird. Ein Beispiel dafür, wie die Lipidzusammensetzung der Membran durch die Funktion oder den Aktivierungsstatus einer Zelle beeinflusst wird, ist die Gegenwart sogenannter „Lipid Rafts“. Bei Lipid Rafts handelt es sich um cholesterin- und glykosphingolipidreiche Mikrodomänen in den zellulären Plasmamembranen, die eine wichtige Rolle beim Proteintransport und bei der zellulären Signalübertragung spielen. Lipid Rafts sind stärker geordnet und enger gepackt als die umgebende Membrandoppelschicht, schwimmen jedoch frei in dieser. Eine erhöhte Konzentration an Lipid Rafts in der Zellmembran wurde bei Zellen beobachtet, die in der extrazellulären Kommunikation aktiver waren (z. B. malignen und aktivierten reifen Zellen) als ruhende reife Zellen oder unreife Zellen (2-3).

Die höhere Permeabilität mancher Zelltypen, beispielsweise anomaler Lymphozyten, führt zum Verlust von Zytoplasma und einer geringeren Zellgröße (Vorwärtsstreuungssignal). Während der WDF-Kanal überwiegend zytoplasmatische Aktivität anzeigt, erkennt der WPC-Kanal anomale Zellen an ihrer Membranzusammensetzung, die zu Unterschieden bei der Größe (Schrumpfung einiger Zelltypen) und einem einfacheren Zugang zur enthaltenen DNA führt, die somit intensiver markiert wird.

Durch die Kombination der beiden Kanäle – sowie der jeweiligen Reagenzien-Sets und Reaktionsbedingungen – wird sowohl die Sensitivität als auch die Spezifität zum Nachweis von reaktiven und malignen Zellen optimiert.

Literatur

1.    Kawauchi S et al. (2014): Comparison of the Leukocyte Differentiation Scattergrams Between the XN-Series and the XE-Series of Hematology Analyzers. Sysmex Journal International Vol.24 No.1.

2.    Tuosto L et al. (2001): Organization of plasma membrane functional rafts upon T cell activation. Eur J Immunol. 31(2): 345 – 9.

3.    Li YC et al. (2006): Elevated Levels of Cholesterol-Rich Lipid Rafts in Cancer Cells Are Correlated with Apoptosis Sensitivity Induced by Cholesterol-Depleting Agents. Am J Pathol. 168(4): 1107 – 18.

4.    Kawauchi S et al. (2013): The Position of Normal Leukocytes on the Scattergram of the Newly Developed Abnormal Cell-detection Channel of the XN-Series Multi-parameter Automated Hematology Analyzers. Sysmex Journal International Vol.23 No.1.

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